Borelioza - o chorobie

Charakterystycznym objawem dla pierwszej fazy choroby, czyli wczesnej boreliozy, są zmiany skórne – rumień wędrujący (EM) o kształcie koła, który może pojawić się w miejscu ukąszenia przez kleszcza i występuje u 1/3 przypadków (nie pojawia się zawsze!). Po tym etapie, w przypadku braku leczenia, w ciągu dni lub tygodni, następuje drugie stadium rozsianego zakażenia, dla którego charakterystyczne są objawy ogólne (rzekomogrypowe), stawowe (odczyn zapalny w dużych stawach – najczęściej kolanowych i barkowych), neurologiczne (np. objawy oponowe, porażenie nerwów czaszkowych, bóle głowy, zaburzenia świadomości, pozagałkowe zapalenie nerwu wzrokowego) i kardiologiczne (Lyme carditis, czyli zapalenie mięśnia sercowego, zaburzenia rytmu pod postacią bloków AV I-III stopnia, tachykardia i inne zaburzenia przewodzenia).

W późnej fazie boreliozy z Lyme pojawia się zapalenie stawów, którym towarzyszą bóle o charakterze wędrującym, zlokalizowane głównie w dużych stawach, zapalenie powięzi i przyczepów mięśniowych oraz przewlekłe zespoły bólowe, trwałe zmiany neurologiczne (np. przewlekłe zapalenie mózgu, zespoły otępienne i parkinsonowskie, neuropatie obwodowe) i psychiczne (np. zaburzenia nastroju, zaburzenia lękowe, zespół depresyjno-lękowy, depresja) lub zanikowe zapalenie skóry. Fazę tę obserwuje się po kilku latach od momentu zakażenia. Choroba może przebiegać jednoetapowo lub wieloetapowo, także bezobjawowo aż do fazy drugiej.

Postępy diagnostyki oraz coraz większa świadomość lekarzy i pacjentów powodują, że rozpoznanie boreliozy stawiane jest coraz częściej w przypadkach patologii dotyczących układu ruchu, układu nerwowego, zaburzeń rytmu serca oraz objawów dotyczących innych narządów i układów. Problemem jest natomiast skuteczne leczenie tej choroby, gdyż standardowe podejście do terapii boreliozy w przeważającej większości przypadków okazuje się skuteczne tylko we wczesnym etapie zakażenia, a w przypadku boreliozy późnej tylko na krótki czas lub zupełnie nieskuteczne.

W pierwszym etapie wykonywany jest test ELISA (immunoenzymatyczna technika fazy stałej) lub inny, równorzędny test (EIA, CLIA, ELFA, IIF, itp.) wykrywający przeciwciała w surowicy krwi pacjenta. Drugim etapem (oficjalnie zalecanym jako potwierdzenie dodatniego wyniku testu przesiewowego) jest test wykonywany metodą immunoblot (np. test Western Blot). Niestety z licznych doniesień naukowych (w tym metaanaliz opublikowanych w ostatnich dekadach oceniających wydolność diagnostyczną badań serologicznych w boreliozie) wynika, że badania wykonywane metodą ELISA (czyli tzw. testy przesiewowe lub skriningowe) mają często zbyt niską czułość diagnostyczną, co oznacza, że u części rzeczywiście zakażonych pacjentów uzyskuje się z ich pomocą wyniki ujemne (są to tzw. wyniki fałszywie ujemne). W ten sposób osoba rzeczywiście chora na boreliozę dowiaduje się o ujemnym wyniku badania (a według oficjalnych zaleceń jest to jednocześnie zakończenie diagnostyki i jednoznaczne wykluczenie boreliozy). Odsetek wyników fałszywie ujemnych uzyskanych w testach ELISA jest różny. Zależy on przede wszystkim od producenta testu, co za tym idzie od składu antygenów krętkowych oraz wartości punktu odcięcia (punktu, który umownie dzieli wyniki testu na dodatnie i ujemne) ustalanej arbitralnie przez producenta testu i może znacznie różnić się dla dostępnych na rynku zestawów odczynnikowych. Bardzo często zdarza się wiec tak, że pacjent wykonując w różnych laboratoriach badania testem ELISA uzyskuje sprzeczne wyniki. Na podstawie badań własnych, zgodność wyników uzyskanych w tych samych próbkach surowic, badanych zestawami trzech różnych producentów wynosi od 7 do ok. 30%! Tak więc problem standaryzacji wyników testu ELISA nie doczekał się dotychczas pełnego rozwiązania i wymaga szybkich działań poprawiających międzylaboratoryjną porównywalność wyników. Podczas interpretacji wyników testu ELISA w boreliozie należy zawsze brać pod uwagę możliwość uzyskania wyniku fałszywie ujemnego (według niektórych danych uzyskuje się ich około 50%), jak i fałszywie dodatniego (reakcja związana z obecnością antygenów niespecyficznych dla krętków). W praktyce więc niemal każdy (zarówno dodatni, jak i ujemny) wynik testu ELISA wymagać będzie potwierdzenia metodą immunoblot, której czułość diagnostyczna jest znacznie wyższa (szacowana jest na 65%-85%).

Standardowo badania serologiczne (ELISA, Western Blot) wykonywane są w klasach IgG i IgM. Powszechnie uważa się, że stwierdzenie przeciwciał w klasie IgM może być traktowane jako dowód aktywnego zakażenia, jednakże każdy wynik badania serologicznego powinien być interpretowany indywidualnie i w powiązaniu z danymi z wywiadu i obrazem klinicznym (objawami). Niektórzy badacze skłaniają się do propagowania wykonania w wybranych przypadkach testów serologicznych dla innych klas przeciwciał. Na przykład szczególnie przydatne wydaje się wykonywanie badań w klasie IgE w początkowych fazach zakażenia u dzieci, a także ocena przeciwciał w klasie IgA – użyteczna w wykrywaniu późnych etapów aktywnego zakażenia (późna postać narządowa boreliozy).

Spośród innych metod diagnostycznych stosowanych w diagnostyce boreliozy w praktyce klinicznej znalazły zastosowanie testy KKI (Krążące Kompleksy Immunologiczne), techniki LTT i EliSpot oraz IGRA, a także metody bezpośrednie: techniki biologii molekularnej (np. rtPCR) oraz test LUAT wykrywający antygeny krętkowe w moczu.

Testy Western Blot

Test Western Blot wykonywany w naszym laboratorium zawiera antygeny pochodzące od europejskich szczepów krętków. W porównaniu z testami innych producentów, zawiera jedną z najbogatszych palet antygenów, co przekłada się na jego dużą skuteczność diagnostyczną. Jakość wyników uzyskiwanych naszym testem Western Blot jest na bieżąco weryfikowana w prestiżowym, międzynarodowym, zewnątrzlaboratoryjnym programie kontroli jakości badań Labquality, w którym uczestniczą czołowe laboratoria na świecie. W 2019 roku uzyskaliśmy w nim najwyższy wynik – tj. 100% zgodności wyników testu Western Blot ze stanem faktycznym – zarówno w przypadku wyników dodatnich, jak i ujemnych.

Testy KKI

Badanie KKI (Krążące Kompleksy Immunologiczne) rekomendowane są w przypadku u Pacjentów, którzy nie uzyskali jednoznacznych wyników tradycyjnych badań wykrywających przeciwciała (np. w teście Western Blot). Badanie wykonywane jest z surowicy krwi, z której za pomocą specjalnych technik izoluje się krążące kompleksy immunologiczne (KKI). Kolejnym etapem badania jest tzw. dysocjacja KKI, czyli „rozbicie” kompleksów i wykrycie uwolnionych z nich przeciwciał przeciwkrętkowych. Do detekcji uwolnionych przeciwciał stosowany jest test Western-blot. Z badań naukowych wynika, że krążące kompleksy immunologiczne (KKI) w boreliozie wykrywane są nawet w 80% próbek surowic pacjentów podejrzanych o zakażenie, u których nie udało się wykryć przeciwciał standardowymi technikami serologicznymi, wykrywającymi wyłącznie wolne przeciwciała.

Testy EliSpot i LTT

Testy EliSpot i LTT oceniają odpowiedź komórkową w boreliozie. Testy te wykrywają specyficzne dla boreliozy limfocyty T efektorowe. Do testów tych zaliczamy badania wykonywane techniką EliSpot i LTT (test transformacji blastycznej limfocytów). Obie metody wykorzystują ocenę odpowiedzi limfocytów na antygeny krętkowe w warunkach laboratoryjnych. Jeśli limfocyt pochodzący od pacjenta miał wcześniej kontakt z krętkiem lub jego antygenami, w trakcie badania wydziela specyficzne związki (cytokiny, np. interferon gamma, IL-2 czy IL-10) lub wbudowuje w swoje struktury znacznik izotopowy, co prowadzi do uzyskania pozytywnego wyniku badania. Badanie EliSpot uważane jest za bardzo swoiste dla boreliozy i często sprawdza się u chorych seronegatywnych (czyli u takich, u których nie udaje się wykryć przeciwciał przeciwkrętkowych w surowicy). Jednocześnie duże znaczenie ma to, czym stymulujemy limfocyty w trakcie badania (skład i swoistość antygenów) – najbardziej wiarygodne wyniki uzyskujemy stosując wysokooczyszczone lub rekombinowane antygeny krętkowe.

Metody biologii molekularnej

Metody biologii molekularnej (PCR i rtPCR) to techniki pozwalające na wykrycie DNA (materiału genetycznego) krętków obecnego w materiale pobranym od pacjenta (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn stawowy, bioptaty skóry, mocz). Za najczulszy uważany jest test wykonywany techniką rtPCR (pozwala również na ocenę ilości kopii DNA krętków). Niestety wadą tych metod jest to, że wykrywają materiał genetyczny w próbce pobranej do badania (np. w próbce krwi żylnej), a nie w całym organizmie. Może się więc zdarzyć tak, że pacjent w późnym okresie zakażenia (gdy krętki osiedliły się już w narządach lub tkance łącznej) uzyskuje ujemny wynik badania technikami biologii molekularnej. Czułość badania techniką PCR może zwiększyć wcześniejsze podawanie antybiotyków lub naturalnych środków działających bakteriobójczo w stosunku do krętków (powoduje to uwolnienie z tkanek do krwi materiału genetycznego krętków), a także specjalne techniki laboratoryjne pozwalające na „zagęszczenie” krętków występujących w materiale biologicznym przeznaczonym do badania.

W praktyce testy metodami biologii molekularnej (np. rtPCR) mają znaczenie w okresie tzw. okna serologicznego, czyli w pierwszych 4-6 tygodniach trwania zakażenia, gdy układ odpornościowy nie wywarza jeszcze dostatecznej ilości przeciwciał, które można wykryć odpowiednią techniką. W tym okresie (od ok. 5-7 dnia do 4-5 tygodnia licząc od momentu zakażenia) krętki występują w największych ilościach we krwi obwodowej, co daje największą szansę ich bezpośredniego wykrycia (tzn. wykrycia obecności ich DNA). W późniejszych etapach zakażenia ilość krążących we krwi krętków spada i badanie metodą rtPCR/PCR przestaje mieć sens (czułość tych testów dla krwi obwodowej opisywana jest na ok. 7%). Nadal jednak sens ma wykonywanie badań molekularnych z takich materiałów jak maź i płyn stawowy, inne materiały pobrane ze stawu (np. fragmenty maziówki i chrząstki stawowej) oraz bioptaty ściany pęcherza moczowego (w badaniach doświadczalnych na myszach wykazano, że jest to miejsce obficie kolonizowane przez krętki).

Test stymulacji wydzielania interferonu gamma z limfocytów (test IGRA – Interferon Gamma Release Assay)

Badanie polegające na ocenie stężenia interferonu gamma w hodowli limfocytów krwi pacjenta poddanych działaniu naturalnych bądź syntetycznych (rekombinowanych lub peptydowych) antygenów krętkowych. Podobnie jak w testach EliSpot i LTT, jeśli pacjent miał wcześniejszy kontakt z krętkami (czyli jest zakażony), w trakcie badania dochodzi do pobudzenia limfocytów i zwiększenia produkcji przez nie niektórych cytokin (np. interferonu gamma). Na podobnej zasadzie oparty jest test Quantiferon Gold stosowany obecnie powszechnie do diagnostyki zakażenia prątkiem gruźlicy. Ujemną stroną testów typu IGRA jest brak standaryzacji ilościowej komórek (limfocytów) poddanych badaniu. Osoby z limfopenią (niskim poziomem limfocytów, np. zakażone HIV) mogą uzyskiwać w testach IGRA fałszywie ujemne wyniki. Natomiast testy typu LTT czy EliSpot we wstępnym etapie wymagają izolacji i ilościowej standaryzacji limfocytów krwi obwodowej pacjenta, a więc zapewniają obiektywne wyniki u osób z limfopenią.

Diagnostykę boreliozy z Lyme uzupełniają również następujące badania:

Ocena subpopulacji limfocytów NK (CD16+ CD3-) o fenotypie CD16+CD57+CD3-

Badanie to przydatne jest u niektórych chorych do monitorowania przebiegu choroby i postępów w jej leczeniu. Uważa się, że spadek bezwzględnej liczby limfocytów CD57+ jest charakterystyczny dla boreliozy i innych chorób przenoszonych przez kleszcze (choć nie występuje we wszystkich jej przypadkach).

Ocena stężenia chemokiny CX-CL13 w płynie mózgowo-rdzeniowym

Jest to dodatkowe narzędzie diagnostyczne przydatne wg niektórych badaczy w diagnostyce neuroboreliozy. Ujemną cechą tego badania jest brak specyficzności dla zakażeń powodowanych przez krętka Borrelia burgdorferi (wzrost CX-CL13 występuje także w innych zakażeniach i chorobach zapalnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN).

Ocena stężenia wybranych składowych dopełniacza C3a i C4a

Jest to potencjalne narzędzie oceniające aktywność zakażenia. Niestety ze względu na wysoką niestabilność biochemiczną i konieczność rygorystycznego przestrzegania warunków czasowo-temperaturowych na etapie przedanalitycznym, oznaczanie tych markerów nie znalazło rutynowego zastosowania w diagnostyce i monitorowaniu pacjentów z boreliozą z Lyme.