LTT Borrelia już w Polsce

Do wykonania badania potrzebna jest próbka krwi żylnej pacjenta pobrana jednocześnie do:

• 3 probówek z płynem ACD lub CPD (zestaw zamknięty) lub do 2 probówek z ACD/NaCl (co najmniej około 20ml krwi żylnej),
• 1 próbówki z aktywatorem krzepnięcia (na skrzep) – około 4-5ml krwi.

Pobrania krwi można dokonać niezależnie od posiłku (nie musi być na czczo).

W przypadku wysyłki materiału, Pacjent dostaje od nas Mobilny Zestaw LTT.

Zarówno protokół badań LTT w CM Wielkoszyński, jak i Institut fur Medicinische Diagnostik w Berlinie są identyczne, jak w publikacji von Baehr et al. „The lymphocyte transformation test for Borrelia detects active Lyme borreliosis and verifies effective antibiotic treatment” opublikowanej w Open Neurology Journal, 2012, 6, (Suppl 1-M5): str. 104-112.

Zastosowanie testów LTT oceniających odpowiedź typu komórkowego w boreliozie ma szczególne znaczenie w przypadkach trudnych diagnostycznie,  np. w przypadkach boreliozy seronegatywnej. LTT Borrelia zalecany jest u pacjentów:

• z negatywnymi wynikami badań serologicznych,
• z defektami odpowiedzi humoralnej, np. z niedoborem immunoglobulin,
• u których zastosowano w celach leczniczych preparaty ludzkich immunoglobulin.

W badaniach naukowych wykazano, że po leczeniu antybiotykowym boreliozy z Lyme wyniki testów LTT normalizują się znacznie szybciej niż wyniki testów serologicznych, co powoduje, że metody oceniające immunologiczną odpowiedź komórkową zalecane są jako metody z wyboru do kontroli skuteczności leczenia.

Testy oceniające odpowiedź komórkową, poprzez wykrywanie specyficznych limfocytów T efektorowych, oceniają aktywność zakażenia. W przeciwieństwie do badań serologicznych, których wyniki mogą pozostawać dodatnie przez wiele miesięcy, a niekiedy nawet lat, po wygaszeniu aktywności zakażenia (np. zjawisko przetrwałej produkcji specyficznych przeciwciał IgM lub wieloletnie, dodatnie wyniki w klasie IgG), testy LTT Borrelia oceniają aktualną sytuację immunologiczną organizmu. Szacuje się bowiem, że czas życia limfocytów T odpowiedzialnych za specyficzną reakcję z danym antygenem wynosi około 5-6 tygodni. Po tym czasie większość z nich ginie, a niewielka część tworzy tzw. limfocyty T pamięci (ze względu na ich niewielką ilość odpowiedź z nimi związana i badana metodą LTT jest mało znacząca).

Istnieją również doniesienia naukowe sugerujące, że pozytywne wyniki testów LTT i EliSpot w boreliozie pojawiają się nieco szybciej po pierwotnym zakażeniu niż swoiste przeciwciała. Okres ten wynosi ok. 3-4 tygodnie (w porównaniu do 4-6 tygodni okna serologicznego) od zakażenia.

Metoda LTT pozwala na ocenę aktualnego statusu zakażenia (aktywne czy nieaktywne) i pozwala na planowanie dalszych etapów leczenia.

Antygeny stosowane w teście LTT do stymulacji limfocytów to:

• lizat krętka Borrelia burgdorferi sensu stricto,
• lizat krętka Borrelia afzelii,
• lizat krętka Borrelia garinii,
• białka Borrelia OspC (antygeny p25),
• kontrola dodatnia (antygeny CMV, grypy i tężca),
• kontrola dodatnia (mitogen - PWM).

W teście LTT Borrelia wprowadzono podwójną kontrolę prawidłowości wykonania badania:

• kontrola dodatnią (antygeny CMV, grypy i tężca) - informuje o prawidłowej żywotności i reaktywności badanych limfocytów. Z założenia większość populacji ludzkiej zetknęła się już wcześniej z antygenami wirusów CMV, grypy i/lub anatoksyną tężcową w sposób naturalny (przebycie zakażenia CMV i/lub grypą) lub w drodze szczepienia (grypa i/lub tężec) i posiada w swoim organizmie limfocyty T pamięci, które po ponownej stymulacji tymi antygenami w hodowli zaczynają proliferować (stosowane antygeny są silnymi induktorami odpowiedzi komórkowej). Stąd za prawidłowy wynik tej kontroli uważana jest wartość indeksu stymulacji powyżej 3,0 (wynik dodatni),
• kontrola dodatnia z mitogenem szkarłatki (PWM) – wykorzystana jest tu tzw. lektyna (związek pochodzenia roślinnego), która w sposób niespecyficzny aktywuje limfocyty T i pobudza je do proliferacji. Odpowiedź proliferacyjną na PWM wykazują wszystkie limfocyty (T i B), niezależnie od tego czy i z jakim antygenem zetknęły się wcześniej w organizmie. Poprzez wykonanie tej kontroli oceniamy stan funkcjonalny limfocytów użytych do badania. Ujemny wynik uzyskany dla kontroli dodatniej z mitogenem szkarłatki (PWM) wskazuje na osłabione lub martwe (niereaktywne) limfocyty użyte w badaniu (uszkodzone np. przez nieprawidłowe warunki transportu). Jest więc dodatkową kontrolą etapu przedanalitycznego (nad którym laboratorium często nie ma kontroli) oraz prawidłowości wykonania właściwego badania LTT. Za prawidłowy wynik tej kontroli uważa się wartość indeksu stymulacji powyżej 10. Wartości niższe wskazują na zły stan funkcjonalny limfocytów i nakazują daleko posuniętą ostrożność w interpretacji wyników, zwłaszcza wyników ujemnych (indeksy stymulacji dla antygenów krętkowych). W tej sytuacji zalecane jest ponowne przeprowadzenie badania z nowo pobranej próbki krwi.

Zasada testu LTT (Lymphocyte Transformation Test) polega na pomiarze ilości zaktywowanych przez antygen limfocytów T efektorowych obecnych we krwi obwodowej. Badanie wykonywane jest w hodowli limfocytów, które po aktywacji swoistym antygenem (np. antygenami krętkowymi) zaczynają intensywnie proliferować (dzielić się).

Test LTT wykorzystywany jest m.in. w diagnostyce chorób zakaźnych, niedoborów immunologicznych i stanów nadwrażliwości na substancje chemiczne (szczególnie metale i leki).

Po raz pierwszy technikę testu LTT opisano w roku 1960. Obecnie, po wielu modyfikacjach i ulepszeniach, test LTT jest bardzo czułym i powtarzalnym narzędziem diagnostycznym i badawczym. Postęp technologiczny jaki dokonał się w ostatnim okresie obejmuje m.in. dobór nowych, kompleksowych pożywek (mediów) stosowanych do hodowli limfocytów, wykorzystanie rekombinowanych antygenów i cytokin „sterujących” wzrostem limfoblastów, a także nowych metod detekcji proliferacji komórek opartych na pomiarze promieniowania beta (klasyczny test LTT z zastosowaniem trytowanej tymidyny), pomiarze cytometrycznym wykorzystującym wewnątrzkomórkowe markery proliferacji (np. Ki-67), wbudowywanie analogów zasad azotowych (BrDU i EDU) lub innych metod detekcji.

Testy EliSpot i IGRA oceniające m.in. wydzielanie interferonu gamma stosowane są powszechnie w diagnostyce gruźlicy (np. test TB-Spot lub Quantiferon Gold) i zalecane jako nieinwazyjna metoda oceniająca kontakt z prątkami gruźlicy typu ludzkiego.

Etapy badania metodą LTT obejmują:

• izolację limfocytów z krwi obwodowej pacjenta, ich płukanie, określenie ich liczby, czystości i żywotności oraz kolejno zawieszenie ich w odpowiedniej pożywce zawierającej autologiczną surowicę (dodatek surowicy i interferonu alfa zapewnia większą specyficzność odpowiedzi proliferacyjnej),
• założenie hodowli limfocytów w probówkach lub dołkach mikropłytki. Hodowlę prowadzi się w kilku powtórzeniach, przy czym do każdej hodowli dodawany jest inny antygen (np. lizat krętków Borelia burgdorferi sensu strictio, Borrelia afzelii lub Borrelia garinii, oczyszczone białka OspC tej bakterii). Jednocześnie prowadzona jest hodowla w czystej pożywce (bez dodatku antygenów, czyli tzw. kontrola negatywna), hodowla w obecności pospolitych antygenów (mieszanina antygenów wirusa CMV, grypy oraz anatoksyny tężcowej – jest to tzw. kontrola dodatnia) oraz hodowla w obecności substancji nieswoiście aktywujących limfocyty T (np. lektyny ze szkarłatki lub fasoli) – jest to tzw. kontrola mitogenu, w której oceniamy żywotność i zdolność limfocytów do aktywacji. W trakcie prowadzenia hodowli (zazwyczaj przez 3-5 dni) limfocyty T, jeśli wcześniej, w organizmie pacjenta miały kontakt z danym antygenem, ulegają aktywacji i intensywnie się dzielą (proliferują). Na kilka godzin przed zakończeniem badania do wszystkich hodowli dodaje się znakowanej trytem tymidyny (jest ona wykorzystywana do budowy DNA przez nowo powstające komórki). Związek ten wbudowany zostaje do DNA intensywnie dzielących się komórek – czyli im silniejsza odpowiedź na antygen/mitogen, tym intensywniejsza proliferacja komórek i większa ilość wbudowanej w DNA tymidyny.
• po zakończeniu hodowli, limfocyty są utrwalane (zabijane), usuwany jest nadmiar niewbudowanej do DNA tymidyny, a następnie umieszczane w tzw. płynie scyntylacyjnym, który pozwala ilościowo określić promieniowanie beta emitowane przez wbudowaną do DNA komórek radioaktywną tymidynę.
• ostatnim etapem testu jest odczyt – pomiar intensywności promieniowania beta w liczniku scyntylacyjnym. Wielkość odczytu świadczy o ilości zaktywowanych przez dany antygen limfocytów T. Wynikiem badania jest tzw. indeks stymulacji (SI), czyli stosunek aktywności promieniowania w hodowli z danym antygenem do aktywności promieniowania w hodowli kontrolnej (limfocyty niestymulowane antygenem, czyli tzw. kontrola negatywna).

Współczesne, diagnostyczne zastosowanie testów LTT w medycynie obejmuje głównie:

• Badania defektów komórkowej odpowiedzi immunologicznej (komórkowych niedoborów odporności) – odpowiedzi na wybrane lektyny (PWM, PHA, Con A) oraz pospolite antygeny wirusowe, bakteryjne i grzybicze (np. grypy, CMV, EBV, VZV, tężca, Candida spp., streptokinazę, itp). Uzyskanie dodatnich wyników tych testów LTT świadczy o prawidłowej immunologicznej odpowiedzi komórkowej.
• Diagnostyka zakażeń – głównie przewlekłych, wewnątrzkomórkowych powodowanych przez wirusy, bakterie, grzyby i pierwotniaki.
• Diagnostyka stanów nadwrażliwości na substancje chemiczne (potocznie nazywanych alergią). Wykorzystanie testów LTT dotyczy w szczególności wykrywania tzw. nadwrażliwości typu IV (opóźnionych reakcji typu komórkowego). Substancjami odpowiedzialnymi za te schorzenie są najczęściej metale (nikiel, chrom, złoto, itp.), leki, składniki materiałów medycznych (np. implantów, cementów kostnych), chemikalia środowiskowe, pestycydy oraz składniki żywności i produkty metabolizmu bakterii i grzybów pleśniowych.